Fin dai primi anni di studio questa colta ragazza manifesta interesse per le materie scientifiche, soprattutto matematica e biologia. Si iscrive alla Facoltà di Medicina dell'Università "La Sapienza" di Roma, dove sarà la prima donna a laurearsi in medicina (nel 1896) dopo l'unità d'Italia. Maria si dedica con passione e metodo alla ricerca in laboratorio. Oltre ai corsi dibatteriologia e microscopia studia anche pediatria all'Ospedale dei bambini, le malattie delle donne, nei reparti del San Giovanni (Roma), e quelle degli uomini al Santo Spirito (Roma) (due ospedali ancora attivi).
Maria è una studentessa molto capace, tanto che vincerà un premio di mille lire dalla Fondazione Rolli per un lavoro in patologia generale. Nel 1895 Maria vince un posto di "aggiunto in medicina" degli ospedali con il diritto di entrare nella Società Lancisiana riservata ai dottori e professori degli ospedali di Roma. Il suo curriculum risulta eccellente in igiene, psichiatria, e pediatria materie che saranno alla base delle sue future scelte. Negli anni che precedono la laurea i suoi impegni di studio si orienteranno sempre più verso ricerche di tipo sperimentale in laboratorio e di osservazione nelle sale del manicomio dell'ospedale di Santa Maria della Pietà di Monte Mario (Roma).
Ottiene la nomina di assistente presso la clinica psichiatrica dell'Università di Roma, in collaborazione con Giuseppe Ferruccio Montesano(con cui ha un sodalizio professionale e affettivo), dedicandosi al recupero dei bambini e delle bambine con problemi psichici, da lei definitianormali.
Attira inoltre la sua attenzione il lavoro svolto da Itard e il suo collaboratore, Edouard Seguin (1812-1880), riguardo alla possibilità di inserimento nella comunità dei bambini e delle bambine anormali, attraverso un percorso di educazione adeguato. Proprio la partecipazione a numerosi convegni pedagogici, in varie città europee, le permetterà di entrare in contatto con la scuola di Itard e Seguin e di apprendere i loro metodi sperimentali di rieducazione dei minorati mentali. Contribuisce con il suo impegno all'emancipazione femminile.
I suoi successi scientifici, conseguiti in un’atmosfera culturale fortemente influenzata dal positivismo, le valsero riconoscimenti e borse di studio, e la portarono a partecipare a una ricerca sui bambini ritardati con un collega, Giuseppe Montesano, a cui fu legata sentimentalmente. Dalla relazione nacque, nel 1898, un figlio, Mario, che partorì di nascosto e affidò a una famiglia. Dopo la morte di sua madre, Maria poté prendere il figlio, ormai quattordicenne, a vivere con sé, dicendo che era un nipote. La rinuncia al figlio e la drammatica fine della sua storia d’amore – dal momento in cui seppe che Montesano avrebbe sposato un’altra donna prese a vestirsi solo di nero, in lutto eterno per quell’amore finito - segnarono senza dubbio un cambiamento fondamentale nella sua vita
Nel 1907, a San Lorenzo, apre la prima Casa dei Bambini, in cui applica una nuova concezione di scuola d'infanzia: Il metodo della pedagogia scientifica, volume scritto e pubblicato a Città di Castello (Perugia) durante il primo corso di specializzazione (1909). Il testo viene tradotto e accolto in tutto il mondo con grande entusiasmo. Al suo arrivo negli Stati Uniti, nel 1913, il New York Tribune la presentò come the most interesting woman of Europe (la donna più interessante d'Europa). Da quel momento, il suo metodo avrebbe riscosso un buon interesse nel Nord America, col tempo poi affievolitosi, fino al ritorno in auge sostenuto da Nancy McCormick Rambusch, fondatrice, nel 1960, della Società Montessori Americana.
Dal successo dell'esperimento romano nasce il movimento montessoriano, dal quale nel 1924 avrà origine la scuola magistrale Montessori e l'"opera Nazionale Montessori", eretta, quest'ultima, in Ente morale e volta alla conoscenza, alla diffusione, all'attuazione e alla tutela del suo metodo. Maria Montessori ne diviene Presidente onoraria.
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